Klassenprojekt:

5. Aktualisierung

Dieses Projekt wird live in der Klasse BTG12 an der Justus-von-Liebig-Schule Waldshut mit Lehrplanbezug durchgeführt. Da die Schülerinnen und Schüler nur alle zwei Wochen Praktikumsunterricht haben, wird die Seite alle vier bis sechs Wochen mit den aktuellsten Ergebnissen aktualisiert. Der Stand des Forschungsprojekts ist im Paper-Stil angelegt. Alle Besucher daher direkt Erfolg und Misserfolg, Umwege bzw. Durchführung eines Alternativprojekts mitverfolgen.

Wegen Erkrankung des Betreuers momentan ausgesetzt. Wir warten auf die S1 Bewilligung zum Weitermachen!

Es wurde bewusst ein Projekt ausgewählt, das mit wenig Ressourcen auskommt und etwa so ähnlich auch von anderen Schulen durchgeführt werden könnte.

Weitere Beispielprojekte im phaenovum

Rekombinante Herstellung von Theophyllin aus Coffein

Coffein ist ein weltweit gebräuchlicher Inhaltsstoff von die Aufmerksamkeit stimulierender Lebensmittel, wie Cafe, Tee oder Energiedrinks. Im Körper wird Coffein durch die Coffein-demethylase zu Theophyllin abgebaut. Bakterienstämme der Art Pseudomonas putida können Coffein biologisch ebenfalls über die Zwischenstufe Theophyllin abbauen. Theophyllin wird auch zur Behandlung von Bronchialasthma eingesetzt. Um diesen nützlichen Wirkstoff aus Coffein zu gewinnen, wurde die Verwertung von Coffein in LB-Medien für Pseudomonas putida und E. coli anhand einer dünnschichtchromatografischen Methode untersucht.

Das Wachstum von E. coli war bei Coffeinkonzentrationen über 1 mg/mL nicht möglich. Trotz des Wachstums von Pseudomonas putida bei dieser Coffeinkonzentration konnten keine Unterschiede bezüglich der Coffeinverwertung festgestellt werden.

Material und Methoden

Verdünnungsreihe von E. coli und P. putida in coffeinhaltigen LB-Medium

Eine 2,5 mg/mL Coffein-Lösung in LB wurde in fünf mal seriell in zweier Schritten in LB verdünnt, anschließend wurden 20 µL einer gefrorenen Stockkultur (-80°C) je eines E. Coli oder P. Putida Stammes zugefügt. Ein sechstes Röhrchen diente als Kontrolle und enthielt nur LB und die je einen der beiden Stämme.

Anschließend wurden die Röhrchen unter Schütteln bei 30°C mehrere Tage inkubiert.

Dünnschichtchromatografie

Dünnschichtchromatografie wurde auf SIL G/UV254 (Merck) mit einem Laufmittel durchgeführt, das 28 mL eines 2-Propanon-1-Butanol (1:1) v/v Gemisches und 10 mL einer 16% Ammoniaklösung enthielt. Nach 15 Minuten wurden die Platten getrocknet und im UV-Licht analysiert. Vor dem Auftrag von Zellkulturüberständen wurden diese 1 min bei 13.000 rpm zentrifugiert und der Überstand bei 4°C gelagert.

Minimalmedium:

LB mit Coffein wurde sterilfiltriert. Coffein-Minimalmedium enthielt 4 g/L Natriumnitrat, 1,5 g/L Kalium-dihydrogenphosphat, 0,5 g/L Di-Natriumhydrogenphosphat, 0,5 mg/L Eisen(III)chlorid-Hexahydrat, 0,01 g/L Calciumchlorid-dihydrat, 0,2 g/L Magnesiumsulfat-Heptahydrat und 2 g/L Coffein (Roth), pH 7 [World Journal of Microbiology and Biotechnology, 12, 1995, 251-256]. Platten wurden mit demselben Bestandteilen hergestellt mit dem Zusatz von 6 g/L Agar.

PCR

PCR wurde mit den Primern 5' caf_de: und 3'caf_de (Eurofins MWG operon) bei einer Annealingtemperatur von 52°C über 30 Zyklen durchgeführt. Eine rekombinant hergestellte Taq-Polymerase (T.W. persönlicher Kontakt) wurde benutzt. Kursiv sind die über die Primersequenzen eingefügten Schnittstellen für NdeI und BamHI dargestellt.

Isolation genomischer DNA

Genomische DNA wurde mit dem Kit DNeasy (Qiagen) nach den Herstellerangaben für Extraktion aus gramnegativen Bakterien isoliert.

Partieller Verdau

150 µL genomische DNA (ca. 5 – 10 µg) wurde mit Sau3AI Puffer und BSA in einem Gesamtvolumen von 180 µL auf 8 Röhrchen vorgelegt (je 10 µL, im 1. Röhrchen 20 µL). In Röhrchen 1 wurde ein µL Sau3AI zugegeben, gemischt und 10 µL in Röhrchen 2 gegeben. Nach Mischen wurde für die Röhrchen 2 bis 8 gleich verfahren, abschließend 10 µL aus Röhrchen 8 verworfen. Auf diese Art wurde eine binäre Verdünnungsreihe für Sau3AI erreicht, ausgehend von 0,5 µL in Röhrchen 1, 0,25 µL in Röhrchen 2, usw. Die Reaktionen wurden für eine Stunde inkubiert. Nach Auftragung auf Agarosegelen wurden geeignete Bedingungen identifiziert und auf eine große Menge genomischer DNA übertragen. Der Verdau wurde durch Zugabe des Bindepuffers aus einem PCR-Reinigungskit (Qiagen) gestoppt und aufgereinigt.

Ergebnisse:

E. coli Wachstum von E. coli auf LB mit Coffein eingeschränkt

Zellen wurden in einer Verdünnungsreihe von Coffein in LB inkubiert. E. coli Zellen waren nicht in der Lage sich in dem Medium LB + 1,25 mg/mL Coffein zu vermehren, während das Wachstum des P. putida Stammes nicht eingeschränkt war.

Keine Verwertung von Coffein im P. putida Laborstamm auf koffeinhaltigen Vollmedien

Um festzustellen, ob das Wachstum von P. putida bei relativ hohen Coffeinkonzentrationen zu einem Abbau von Coffein führt, wurden die Kulturen durch Zentrifugation in Pellet und Überstand getrennt und die Überstände anschließend durch Dünnschichtchromatographie analysiert.

Bei der Dünnschichtchromatografie konnte in den Zellkulturüberständen von P. putida keine verringerte Konzentration an Coffein festgestellt werden (Bild 1). 

Bahn 1: Theophyllin, Kulturüberstände mit ansteigender Coffeinkonzentration in LB, Bahn 2,4,6,8,10,12 E. coli 3,5,7,9,11,13 P. putida. Bahn 14: Doppelt konzentriertes LB-Coffein Medium als Kontrolle.

Zusätzliche Banden, die nur bei einem der beiden Stämme vorkommen, können nicht durch die Coffeinverwertung zustandekommen, da diese Banden auch in der Negativprobe (Kultur ohne Coffein zu finden sind).

Wachstum und Verwertung von Coffein bei P. putida und Naturisolaten in Minimalmedien

Um zu überprüfen, ob der Abbau von Coffein metabolisch reprimiert wird, wurden Pseudomonas Putida und Naturisolate in Minimalmedien (siehe Material und Methoden) angezogen.

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